W drugiej odsłonie serii przenosimy się do roku 1476, czyli w epokę Renesansu i zwiedzamy między innymi takie miejsca jak Florencja, Wenecja i Rzym. Przemierzamy nie tylko miasta, ale i leżące pomiędzy nimi tereny rolnicze (np. Toskanię). Wcielamy się w postać Desmonda, który przy użyciu urządzenia Animus poznaje losy swojego przodka - Ezio Auditore de Firenze. Twórcy przygotowali rozbudowany główny wątek fabularny oraz wiele pobocznych misji, podzielonych na kilka rodzajów. Co ciekawe, w grze pojawia się wiele znanych postaci historycznych, jak np.: Lorenzo de Medici oraz Leonardo da Vinci.

Podczas wykonywania kolejnych zadań musimy przede wszystkim skradać się, wtapiać w tłum oraz atakować odpowiednie cele. Sprawa jest znacznie trudniejsza, gdyż teraz napotykamy coraz bardziej wymagających przeciwników. Niektórzy z nich potrafią nawet wspinać się równie sprawnie jak bohater, a inni są znacznie czujniejsi i sprytniejsi. Na szczęście w razie niezbyt udanego pojedynku możemy udać się do pobliskiego lekarza żeby wyleczyć odniesione obrażenia.

Do gry wprowadzono kilka innych ciekawych modyfikacji, odróżniających ją od części pierwszej. Podstawową nowością jest pływanie, które otwiera dodatkowe możliwości eksploracji świata. Oczywiście główny zabójca nadal może wspinać się na najwyższe budowle, co zresztą jest ważnym elementem rozgrywki. Powiększono wachlarz sposobów eliminowania wrogów – można ich atakować chociażby z dachów, zastrzelić z ukrytego w rękawie pistoletu oraz wyrywać im broń z rąk. Każdym typem oręża bohater walczy w nieco inny sposób. Sednem systemu walki pozostaje nadal system kontrowania i odbijania ciosów.

Oprócz tego do naszej dyspozycji oddano kilka wynalazków samego Leonarda Da Vinci, w tym między innymi maszynę latającą oraz zupełnie nowe ostrza (wspomniany pistolet, ostrza z pojemnikami na truciznę). W lokacjach poukrywanych jest też wiele dodatkowych przedmiotów – sto piórek i ponad trzysta skrzyń ze skarbami. Za ich znalezienie otrzymujemy rozmaite bonusy – w tym chociażby pelerynę rodu Auditore a nawet zbroję Altaira, czyli bohatera pierwszej odsłony serii.

Niejednokrotnie główny bohater naraża się lokalnym władzom, ale na szczęście może on zmniejszyć ich zainteresowanie swoją osobą. Aby tego dokonać możemy między innymi zrywać plakaty z podobizną Ezio, eliminować świadków naocznych zbrodni lub przekupywać mówców. Przerywniki filmowe zastąpiono natomiast widowiskowymi scenami, w których uczestniczymy wciskając odpowiednio szybko wskazane przyciski (quick time events). Oprawa wizualna tytułu stoi na bardzo wysokim poziomie, więc poszczególne lokacje mogą zapierać dech w piersiach.