Historia przedstawiona w grze zaczyna się dwa lata po wydarzeniach z pierwszej części, w której Peter Parker pojawił się na ulicach Nowego Yorku we wcieleniu Spider-Mana jako pogromca zła. Teraz jednak znajduje się w zdecydowanie gorszej sytuacji. W skutek wypadku w laboratorium Otto Octavius, znany w przestępczym światku jako Doctor Octopus uzyskał niesamowite zdolności. Szalony naukowiec wyposażony w mechaniczne i sterowane za pomocą fal mózgowych macki ma zamiar raz na zawsze pozbyć się Spider-Mana, którego wini za ten incydent. Jakby tego było mało - gracz musi stawić czoła również innemu zagrożeniu. Jest nim Lizard - potwór z piekła rodem, który powstał wskutek nieudanego eksperymentu z regeneracją tkanek.