Professor Layton vs. Ace Attorney to zgodnie z nazwą tzw. crossover, czyli grą, w której występują bohaterowie kilku różnych serii. W tym konkretnym przypadku dochodzi do spotkania postaci z dwóch najpopularniejszych cyklów przygodówek wydawanych konsole przenośne firmy Nintendo, czyli Professor Layton oraz Phoenix Wright: Ace Attorney.

Akcja gry toczy się w zupełnie nowym uniwersum, które nie pojawiło się w poprzednich grach obu tych serii. Pewnego dnia do tego świata przeniesiony zostaje Phoenix Wright i jego asystentka Maya Fey oraz Profesor Layton i jego towarzysz Luke Tritton. Na miejscu znajdują tajemniczy średniowieczny gród nazywany Miastem Labiryntu (Labirynt City). Miejsce to uczyniły swoim domem wiedźmy, które kryją się w cieniach, a na domiar złego całą okolicą rządzi czarny charakter znany jako Bajarz (Story Teller). Fabuła obraca się wokół młodej dziewczyny imieniem Mahone, która oskarżona zostaje o bycie czarownicą. Phoenix Wright bierze na swoje barki obowiązek reprezentowania jej w procesie o czary, podczas gdy Profesor Layton postanawia rozwiązać zagadkę, jaką kryje Miasto Labiryntu.