Casey Hudson, kierownik projektów w BioWare, zapowiedział, że gracze powinni zatrzymać pliki zachowanych stanów gry z Mass Effect[5], ponieważ wybory dokonane przez graczy w pierwszej części będą miały wpływ na postaci przedstawione w Mass Effect 2[6]. Gracze, którzy nie grali w pierwszą część, zaczynają grę nową postacią, a w czasie rozgrywki zostaje im streszczona fabuła poprzedniczki, o ile jest to konieczne do zrozumienia fabuły[5]. W grze pojawiają się również postaci z pierwszej części, o ile tylko w tejże nie zostały zabite[6].
Akcja gry rozgrywa się dwa lata po wydarzeniach z części pierwszej, czyli w roku 2185. Statek SSV Normandia zostaje zaatakowany przez tajemniczą rasę Zbieraczy oraz doszczętnie zniszczony. Większości załogi udaje się przeżyć dzięki kapsułom ratunkowym. Komandor Shepard ginie podczas ratowania Jokera, pilota statku.
Tajemnicza organizacja Cerberus przywraca go do życia, bo tylko on może uratować ludzi przed ostateczną zagładą. Nowym szefem komandora Sheparda zostaje Człowiek Iluzja. Od niego gracz dowiaduje się o naszej misji – powstrzymaniu Zbieraczy. W tym celu nowa SR2 Normandia musi przejść przez przekaźnik Omega 4. Nikt nie wie dokąd on prowadzi, ani co znajduje się po drugiej stronie, ponieważ nikt jeszcze stamtąd nie wrócił.
