| Wykaz skrótów 6
1. Fenyloketonuria - genetycznie uwarunkowany blok metabolizmu 7 1.1. Reakcja hydroksylacji fenyloalaniny 8
1.2. Struktura oraz regulacja transkrypcji genu hydroksylazy fenyloalaninowej 10 1.3. Polimorfizm genu hydroksylazy fenyloalaninowej 12 l .4. Strategia badań mutacji genu hydroksylazy fenyloalaninowej 13 1.4.1. Polimorfizm konformacyjny pojedynczej nici 14 1.4.2. Metoda chemicznego rozszczepiania 14 l .4.3. Elektroforeza żelowa w gradiencie czynnika denaturującego 14 l .4.4. "Nieuprawniona" transkrypcja 15 1.5. Zmienność genu hydroksylazy fenyloalaninowej 15 1.5.1. Mutacje modyfikujące strukturę hydroksylazy fenyloalaninowej 16 l .5.2. Mutacje nie powodujące zmian struktury hydroksylazy fenyloalaninowej 16
1.5.2.1. Sekwencje składające się ze zmiennej liczby tandemowych
powtórzeń 16
l .5.2.2. Sekwencje składające się z krótkich powtórzeń tandemowych 16 1.6. Zależność pomiędzy genotypem a fenotypem 17 1.6.1. Ekspresja hydroksylazy fenyloalaninowej w układzie in vivo 17 l .6.2. Ekspresja hydroksylazy fenyloalaninowej w układzie in vitro 18 l .7. Fenyloketonuria jako model do badań mechanizmów ekspresji genu 19 1.8. Powstawanie i rozprzestrzenianie się mutacji w populacjach 23
2. Cel badań 26
3. Materiały i metody 28
3.1. Analiza haplotypów genu hydroksylazy fenyloalaniny na podstawie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA 28 3.1.1. Chorzy 28 3. l .2. Analiza Southema 28
3.2. Wykrywanie mutacji znanych 28 3.2. l. Chorzy 28 3.2.2. Wykrywanie mutacji przy pomocy łańcuchowej reakcji polimerazy w powiązaniu z hybrydyzacją z krótkimi sondami specyficznymi dla allelu 29 3.2.3. Wykrywai ,e mutacji przy pomocy łańcuchowej reakcji polimerazy w powiązaniu
z analizą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA 29
3.2.4. Wykrywanie mutacji z wykorzystaniem miejsca restrykcyjnego tworzonego w łańcuchowej reakcji polimerazy 3B
3.2.5. Wykrywanie mutacji R408W w DNA chorego, izolowanym z wysuszonej kropli krwi 30
3.3. Wykrywanie nowych mutacji 31 3.3.1. Sekwencjonowanie DNA 31
3.3.2. Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego 31 3.4. Badanie przejściowej ekspresji mutacji R241H w komórkach ludzkich in vitro 32 3.4.1. Chory 32
3.4.2. Ukierunkowana mutageneza cDNA hydroksylazy fenyloalaninowej 3.4.3. Hodowla komórek in vitro oraz transfekcja 32 3.4.4. Pomiary aktywności hydroksylazy fenyloalaninowej oraz lucyferazy 3.5. Badania mutacji IVSlOnt-3 występującej w powiązaniu z delecją eksonu 11 w mRNA chorego 33 3.5.1. Chory 33
3.5.2. Synteza cDNA hydroksylazy fenyloalaninowej chorego 33 3.5.3. Klonowanie i ukierunkowana mutageneza 34 3.5.4. Transkrypcja i splicing 34
3.5.5. Identyfikacja pętli oraz mapowanie miejsca rozgałęzienia 35 3.5.6. Analiza ilościowa produktów splicingu 35 3.5.7. Analiza cDNA hydroksylazy fenyloalaninowej chorego posiadającego delecję
ciągu piiymidynowego w eksonie 11 36
4. Wyniki 37
4.1. Haplotypy genu hydroksylazy fenyloalaninowej 37 4.2. Najczęstsze mutacje genu hydroksylazy fenyloalaninowej 39 4.3. Wykrywanie mutacji R408W w DNA izolowanym z wysuszonej kropli krwi chorego 41 4.4. Mutacja w allelach hydroksylazy fenyloalaninowej posiadających haplotyp 5 42 4.5. Czy ekson 11 genu hydroksylazy fenyloalaninowej zawiera "gorące miejsce" mutacji 43 4.6. Zmienność genu hydroksylazy fenyloalaninowej wykryta przy pomocy elektroforezy żelowej w gradiencie czynnika denaturującego 44
4.7. Przejściowa ekspresja mutacji R241H w komórkach ludzkich in vitro 4.8. Mutacja C-»T w pozycji -3 intronu występująca w powiązaniu z wykluczeniem eksonu liż mRNA hydroksylazy fenyloalaninowej 45 4.8. l. Wpływ mutacji C-»T na wydajność reakcji splicingu in vitro mRNA
hydroksylazy fenyloalaninowej 49
4.8.2. Wpływ mutacji C-»T na tworzenie spliceosomu 51 4.8.3. Miejsce rozgałęzienia intronu 10 pre-mRNA hydroksylazy fenyloalaninowej 52 4.8.4. Wpływ sekwencji ciągu pirymidynowego ne wydajność splicingu intronu 10
pre-mRNA hydroksylazy fenyloalaninowej 55
4.8.5. Badanie wpływu sekwencji bogatej w pirymidyny eksonu 11 na splicing
intronu 10 pre-mRNA hydroksylazy fenyloalaninowej 59
5. Dyskusja 60
5.1. Haplotypy genu hydroksylazy fenyloalaninowej w populacji polskiej 60 5.2. Zaburzenie równowagi sprzężeń wynikające z powiązania haplotypu 2 z mutacją
R408W 60
5.3. Mutacje warunkujące fenyloketonurię w populacji polskiej 61 5.4. Wpływ sekwencji DNA na powstawanie mutacji genu hydroksylazy fenyloalaninowej 62 5.5. Przydatność testów molekularnych do wykrywania nosicielstwa w populacji polskiej 63 5.6. Próba korelacji genotypu z fenotypem klinicznym chorego 64 5.7. Mutacja C-»Tw pozycji -3 intronu przyczyną zaburzenia splicingu pre-mRNA hydroksylazy fenyloalaninowej 65
5.7. l. Ciąg pirymidynowy i miejsce 3' rozpoznania splicingu 66 5.7.2. Miejsce rozgałęzienia intronu 10 pre-mRNA hydroksylazy fenyloalaninowej 68 5.7.3. Rozważania na temat mechanizmu zaburzenia splicingu przez mutację C-»T 69
Wnioski 71 Piśmiennictwo 72 Streszczenie 79
Molecular basis ofphenylketonuria: Gene mutations and abnormalities of maturation of phenylalanine hydroxylase pre-mRNA (summary) 80 | 
