W Duke Nukem: Manhattan Project cofamy się nieco w czasie, do momentu gdy pewne tajemnicze osoby postanowiły odkryć nowe źródło radioaktywnej energii, gdy Duke zajęty był walką z obcymi najeźdźcami. Źródło to charakteryzowało się jednak jednym bardzo niebezpiecznym efektem ubocznym: w jego obecności ludzie mutowali zamieniając się w krwiożercze bestie. Gdy w końcu ten nieudany eksperyment doprowadził do zamknięcia całego podziemnego segmentu metra, rząd zdecydował się wezwać Duke Nukem. Gracz musi rzecz jasna pomóc w walce z niebezpiecznymi mutantami oraz odnaleźć i zniszczyć źródło promieniowania w podziemiach Nowego Yorku.

Do przejścia przygotowano osiem olbrzymich map rozgrywających się w nowojorskim Big Apple. Po drodze znajdujemy nowe rodzaje broni oraz power-upy bardzo przydatne w walce z wieloma przeciwnikami. Niespodzianką jest dostępność nowego rodzaju broni organicznej, siejącej prawdziwe spustoszenie w szeregach potworów. Całość wykonana jest w trójwymiarowej grafice z widokiem w perspektywie trzeciej osoby.