Wśród obcych pojawiają się zarówno „starzy znajomi” (np. świnie w mundurach i Octabrainy), jak i zupełnie nowi przeciwnicy. W Duke Nukem Forever nie brakuje również potężnych bossów. Walki z nimi zostały jednak urozmaicone w porównaniu do pierwowzoru, co uwidacznia się między innymi w efektownych scenach dobijania potężnych przeciwników. W trakcie przygody odwiedzamy zróżnicowane lokacje, począwszy od miast, poprzez kaniony, tereny pustynne, ale także obszary przemysłowe. Część lokacji pokonujemy na własnych nogach, a niekiedy posługujemy różnymi pojazdami. Nie zabrakło też sekwencji, w których przy pomocy broni stacjonarnej musimy odpierać zmasowane ataki wrogów.

Tym razem Duke zamiast tradycyjnego życia został wyposażony we wskaźnik ego. Działa on na tej samej zasadzie, co życie, czyli jego spadek do zera powoduje zgon, jednak takie rozwiązanie doskonale pasuje do naszego bohatera. Twardziel pokroju Duke'a nie otrzymuje obrażeń, przeciwnicy są w stanie wyłącznie urazić jego dumę. Tak jak w przypadku większości współczesnych strzelanin, ego regeneruje się automatycznie, w przerwach między walkami.

Wśród arsenału, jaki trafia w ręce księcia, znalazło się kilka nowych broni. Mamy więc pistolety, strzelby czy karabiny maszynowe, a także znane z pierwszej części bojowe rękawice wystrzeliwujące rakiety (Devastator), „pomniejszacz” wrogów (Shrink Ray) oraz zdalnie detonowane ładunki wybuchowe (Pipe Bombs). Wśród nowych narzędzi zagłady znalazł się karabin snajperski, który pozwala na bardzo skuteczną walkę na większym dystansie. Jak przystało na Duke'a, broń ta posiada ogromną siłę ognia. Eksplodujące ciała, odstrzelone kończyny i headshoty zrywające głowy z karków, są w tym przypadku normą.