W drugiej odsłonie serii przenosimy się do roku 1476, czyli w epokę Renesansu i zwiedzamy między innymi takie miejsca jak Florencja, Wenecja i Rzym. Przemierzamy nie tylko miasta, ale i leżące pomiędzy nimi tereny rolnicze (np. Toskanię). Wcielamy się w postać Desmonda, który przy użyciu urządzenia Animus poznaje losy swojego przodka - Ezio Auditore de Firenze. Twórcy przygotowali rozbudowany główny wątek fabularny oraz wiele pobocznych misji, podzielonych na kilka rodzajów. Co ciekawe, w grze pojawia się wiele znanych postaci historycznych, jak np.: Lorenzo de Medici oraz Leonardo da Vinci.