Gracz realizuje całość zadań w obrębie tętniącego życiem Rzymu, który znajduje się pod rządami złego rodu Borgia. Aby wyzwolić poszczególne dzielnice spod panowania tyrana trzeba wyeliminować wieże sprawujące nad nimi kontrolę. Pozyskiwanie poparcia mieszkańców doprowadza do odblokowywania dodatkowych frakcji, a co za tym idzie – kolejnych misji. W czasie wykonywania zadań spotykamy znane postacie historyczne, jak Leonardo da Vinci, Niccolo Machiavelliego, czy Caterinę Sforzę.

W Bractwie do dyspozycji graczy oddanych zostało wiele broni, w tym topór, wachlarz, strzykawka, szpony oraz tzw. Switch Blade, czyli ukryte ostrze używane przez Templariuszy. W grze pojawiają się ponadto kolejne machiny Leonardo da Vinci – m.in. spadochron oraz usprawniona maszyna latająca. Bohater otrzymał również kilka nowych ciosów – teraz Ezio nie patyczkuje się tak z wrogami i może wyprowadzać brutalne sekwencje uderzeń.