Anna Michnik


MIKROKALORYMETRYCZNE BADANIA

PRZEMIAN KONFORMACYJNYCH ALBUMINY

PODDANEJ DZIAŁANIU

WYBRANYCH CZYNNIKÓW FIZYKOCHEMICZNYCH



Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego — Katowice 2009

Stron 142, bibliografia, tab., rys., wykr., ilustr.,
miękka oprawa foliowana, format ok. 24 cm x 17 cm

 
Niski nakład !!!


Z notatki wydawniczej :

W pracy przedstawiono i przedyskutowano wyniki badań przemian strukturalnych
surowiczej albuminy ludzkiej i wołowej, przebiegających pod wpływem kontrolowanego
wzrostu temperatury w roztworach wodnych. Zastosowanie wysokiej jakości czułego
mikrokalorymetru pozwoliło prześledzić subtelne zmiany zachodzące w białku pod
wpływem takich czynników środowiskowych, jak radiowe (RF) i ultrafioletowe (UV)
promieniowanie elektromagnetyczne. Udokumentowano występowanie różnic
w przebiegu termicznego rozfałdowania albuminy wolnej i zawierającej kwasy tłuszczowe,
reakcji obydwu form białka na promieniowanie UV oraz w wiązaniu denaturantów (etanolu).
Połączenie danych kalorymetrycznych z odpowiednim modelem matematycznym
pozwoliło scharakteryzować założony proces termicznej denaturacji
trójdomenowego białka, jakim jest albumina.


WPROWADZENIE :

Inspiracją do badań przemian konformacyjnych białek zachodzących pod wpływem
czynników fizykochemicznych jest wiele niewyjaśnionych w pełni kwestii
dotyczących zależności pomiędzy zmianą natywnej struktury białek w wyniku
oddziaływania ze środowiskiem a skutkami, jakie te modyfikacje niosą dla organizmów
żywych. Narażenie środowiskowe jest zazwyczaj narażeniem mieszanym na wiele
czynników o różnych stężeniach bądź natężeniach.
Efekt końcowy jednoczesnego działania wielu czynników zależy od interakcji między nimi,
a w przypadku organizmów żywych także od ich indywidualnych reakcji i odpowiedzi
na bodźce środowiskowe. Prowadzenie badań in vitro, mających na celu poznanie
wpływu każdego z czynników oddzielnie lub ich ograniczonej kombinacji nie na obiekty żywe,
lecz na ich wyodrębnione składniki, nie jest w stanie zastąpić badań in vivo.
Jedną z wielu przyczyn jest trudność wiernego odtworzenia warunków fizjologicznych,
na przykład tzw. zatłoczenia molekularnego panującego w komórce, od którego
w bardzo istotny sposób uzależnione są konformacje makromolekuł, aktywność
enzymów i szybkość reakcji biochemicznych (MINTON, 2001, 2005; ELLIS, 2001;
CHEBOTAREVA et al., 2004). Na obecnym etapie wiedzy selektywne badania modelowe,
mimo określonych założeń upraszczających, nadal wnoszą istotny wkład w poznanie
i zrozumienie zjawisk fizycznych leżących u podłoża procesów, wywołujących określone
skutki w danych warunkach środowiskowych.
Białka, podstawowe składniki każdej komórki, biorą udział w licznych procesach fizjologicznych:
przenoszeniu i magazynowaniu różnych substancji, utlenianiu tkankowym, krzepnięciu krwi,
procesach odpornościowych, procesach widzenia, przewodzeniu bodźców nerwowych,
skurczu mięśni, dostarczaniu energii, regulacji procesów metabolicznych — stężenia jonów,
ciśnienia osmotycznego.
Wszystkie te funkcje wypełniają one dzięki odwracalnym zmianom specyficznej struktury
przestrzennej każdego z nich.
Zdobycie wszechstronnych informacji na temat trwałości struktur białkowych jest ważne
w aspekcie współczesnych badań farmaceutycznych. W ostatnich latach powstaje
wiele nowych leków na bazie białek, przy czym największym problemem jest zwykle
mała trwałość tych farmaceutyków. Dodatkowo procesy technologiczne prowadzące
do ostatecznej formy bezpiecznego i skutecznego (aktywnego) preparatu, składają się
z procedur, które mogą modyfikować białko w niepożądany sposób.
Wyjściowy materiał poddawany jest np. działaniu promieniowania jonizującego, UV (254 nm)
czy termicznej sterylizacji w celu zniszczenia bakterii i wirusów.
Te działania nie pozostają prawdopodobnie bez wpływu na strukturę i właściwości makromolekuł.
Albumina jest to białko surowicy krwi, które obficie występuje w organizmach ssaków.
Pomimo tego że zarówno struktura, jak i podstawowe funkcje albuminy zostały stosunkowo
dobrze poznane, nie przestaje ona być obiektem wszechstronnych badań naukowych.
Wybrane, zdaniem autorki ważne w kontekście pracy, informacje na temat tego białka
przedstawiono w rozdziale 2. Poznanie wpływu różnych czynników fizykochemicznych
na właściwości albuminy przyczynia się do zrozumienia zaburzeń jej funkcji.
Termiczne charakterystyki albuminy dostarczają cennych wskazówek w kontekście
jej zastosowań praktycznych, np. w laserowym zespalaniu tkanek (BLEUSTEIN et al., 2000 a, b),
metodzie alternatywnej do zszywania chirurgicznego. Albuminy używa się jako „lutu”
w celu poprawy konsystencji i zwiększenia wytrzymałości blizny. Termiczna pasteryzacja
roztworów albuminy poprzedza ich zastosowania kliniczne (przeprowadza się ją
ze względu na możliwość obecności wirusów, np. HIV, opryszczki, zapalenia wątroby).
Badania termicznej denaturacji albuminy dostarczają ważnych informacji na temat
wewnątrz- i międzydomenowych oddziaływań istotnych dla stabilizacji aktywnej formy białka.
Zachowanie się albuminy pod wpływem temperatury badano różnymi metodami,
a najczęściej techniką dichroizmu kołowego (CD) (TAKEDA et al., 1989; ARAKAWA et al.,
2000; WATANABE et al., 2001; KRAGH-HANSEN et al., 2005) i różnicowej kalorymetrii
skaningowej (DSC) (ANRAKU et al., 2007; BARONE et al., 1995; FARRUGGIA, PICÓ, 1999;
GIANCOLA et al., 1997; MICHNIK, 2003; ROSS, SHRAKE, 1988; TIKTOPULO et al., 1985;
YAMASAKI et al., 1990, 1991, 1992).
Nowoczesna aparatura pozwala na badanie zmian zachodzących w strukturze białek
na poziomie molekularnym. Uchwycenie tych zmian i powiązanie ich z funkcjami białek
wzbogaca wiedzę dotyczącą prawidłowości funkcjonowania naszych organizmów,
a także podłoża niektórych chorób. Zaburzenia konformacyjne białek leżą u podstaw
takich chorób układu pozapiramidowego jak: choroba Parkinsona, otępienie,
z ciałami Lewy’ego (ang. Dementia with Lewy bodies — DLB), postępujące porażenie
nadjądrowe. Nieprawidłowa struktura białek ma także związek z chorobą Alzheimera
i chorobą prionową BSE.
Relacje między strukturą a funkcją białek zależą silnie od oddziaływań z rozpuszczalnikiem.
Problem ten jest szeroko badany od wielu lat i mimo to wciąż żywo dyskutowany.
Ponieważ większość białek funkcjonuje w roztworach wodnych, znaczenie wody
i zrozumienie różnych aspektów oddziaływań w środowisku wodnym jest szczególnie ważne.
Aktywność białka oraz jego konformacyjna elastyczność są w dużym stopniu
uwarunkowane obecnością wody.
Struktura natywnych białek jest określona przez równowagę wewnątrz- i międzymolekularnych
oddziaływań pomiędzy różnymi resztami aminokwasowymi oraz tymi resztami
i molekułami wody otaczającymi białka. Ta równowaga określa tendencję poszczególnych
reszt aminokwasowych do preferowania wnętrza lub powierzchni białka.
Może być zmieniona np. przez denaturanty czy stabilizatory obecne w roztworze,
jak również przez zmiany temperatury, ciśnienia, pH czy siły jonowej.
Ogólna struktura białek jest wtedy osłabiana lub wzmacniana, zależnie od właściwości molekuł.
Badanie tych zmian dostarcza wartościowej informacji na temat roli rozpuszczalnika
w utrzymaniu konformacji natywnego białka. Krótkie omówienie oddziaływań istotnych dla stabilizacji
struktury białka oraz czynników modyfikujących ją zawarto w rozdziałach D II i D III Dodatku.
Od dawna bada się wpływ podstawowych czynników fizycznych: temperatury i ciśnienia,
na trwałość struktur białkowych. Paradoksalnie, śledzenie procesu denaturacji,
a więc niszczenia struktury białka, pozwala lepiej poznać i zrozumieć oddziaływania kluczowe
w procesie fałdowania białka do specyficznej dla niego konformacji oraz istotne dla stabilizacji
tej struktury. Większość zagadnień dyskutowanych w tej pracy skupia się wokół
termicznej denaturacji białek, a pewne aspekty denaturacji ciśnieniowej
przedyskutowano w rozdziale D III Dodatku.
Konformacja białka może być również zmieniana pod wpływem innych czynników fizycznych,
np. jonizującego promieniowania gamma (SZWEDA-LEWANDOWSKA et al., 1976; FESSAS
et al., 1998; LEE et al., 2000; LEE, SONG, 2002; CHO, SONG, 2000; CIEŚLA et al., 2000).
Autorzy niektórych prac zwracają uwagę, że także podczas badań krystalograficznych
struktury białek promieniami X ulega ona zmianie, co powoduje różnice pomiędzy
strukturami: natywną i stwierdzoną na podstawie eksperymentu dyfrakcyjnego
(NAVE, 1995; CARUGO, CARUGO, 2005).
Wyniki badań mikrokalorymetrycznych prezentowane w tej pracy wykazały,
że także promieniowanie elektromagnetyczne niejonizujące z zakresu UV oraz radiowego
prowadzi do strukturalnych modyfikacji jednego z głównych białek osocza — albuminy
(MICHNIK et al., 2004 a, b, 2008).
Pomiar kalorymetryczny umożliwia bezpośrednie wyznaczenie makroskopowej
wielkości termodynamicznej — entalpii badanego procesu. Ze względu na kompensację
entalpowo-entropową sama wartość zmian energii swobodnej Gibbsa (entalpii swobodnej),
miary konformacyjnej stabilności białka nie jest wystarczająca do prawidłowego
opisu termodynamiki przemiany. Znaczące udoskonalenie aparatury kalorymetrycznej
oraz pojawienie się komercyjnie dostępnych kalorymetrów o wysokiej czułości,
np. różnicowych kalorymetrów skaningowych DSC, charakteryzujących się
czułością ułamka mikrowata, przyczyniło się do zastosowania metod kalorymetrycznych
w badaniach przemian zachodzących w białkach pod wpływem temperatury.
Dobrej jakości mikrokalorymetry umożliwiają detekcję nawet stosunkowo słabych,
subtelnych zmian wywoływanych w energetyce tych przemian różnorodnymi czynnikami.
Mikrokalorymetr VP DSC (MicroCal Co.), stosowany w badaniach, których wyniki
prezentowane są w tej pracy, należy do klasy takich wysokoczułych kalorymetrów,
przeznaczonych do badania próbek w stanie ciekłym i w szczególności bardzo dobrze
nadaje się do badania roztworów białek.
Obecnie zgromadzono pokaźny materiał doświadczalny dotyczący badań termicznej
denaturacji białek metodą DSC. Złożoność obserwowanych przemian, ich zależność
od specyfiki badanych struktur białkowych, jak i wielu czynników doświadczalnych
stanowi o atrakcyjności problematyki, a jednocześnie utrudnia porównywanie wyników
uzyskiwanych przez różnych autorów.
W niniejszym opracowaniu ograniczono się do zaprezentowania i przedyskutowania
na podstawie dostępnych danych literaturowych zagadnień dotyczących
termicznych przemian albuminy. Wiele z zawartych treści ma jednak uniwersalny
charakter i ilustruje różnorodność oraz specyfikę problemów związanych z analizą
procesów przebiegających w roztworach białek pod wpływem wzrostu temperatury.
Termiczne rozfałdowanie białka uważa się za przejście globalne, co oznacza,
że procesowi temu w określonych warunkach ulega cząsteczka jako całość,
a nie polega ono na stopniowym osłabieniu struktury ze wzrostem temperatury
(JACKSON, 2006). Dla małych białek globularnych proces ich termicznej denaturacji
może być często rozpatrywany jako dwustanowy, na co wskazuje zgodność
entalpii kalorymetrycznej i van’t Hoffa (PRIVALOV, 1979), tzn. że w temperaturach
bliskich przejściu współistnieją dwa stany: natywny i rozfałdowany.
W przypadku większych białek, wielodomenowych lub złożonych z kilku podjednostek,
opis procesu staje się bardziej skomplikowany. Jeśli wszystkie podjednostki
ulegają rozfałdowaniu równocześnie, przejście nazywane jest kooperatywnym.
Kooperatywnemu rozfałdowaniu białka złożonego z n identycznych podjednostek
towarzyszy efektywna zmiana entalpii na mol n-meru, czyli entalpia van’t Hoffa n razy
większa od entalpii rozfałdowania pojedynczej podjednostki.
Entalpia van’t Hoffa określa stromość przejścia: im większa kooperatywność,
tym większa efektywna entalpia i przejście bardziej strome.
Porównanie entalpii kalorymetrycznej i van’t Hoffa dostarcza informacji na temat
liczby kooperatywnych podjednostek ujawniających się podczas przejścia.
Denaturację niektórych dużych białek można opisać jako sumę procesów denaturacji
ich składowych domen.
Połączenie danych kalorymetrycznych z odpowiednim modelem teoretycznym
pozwala uzyskać informacje na poziomie molekularnym. Celem autorki tej
pracy było zaadaptowanie dostępnych modeli analizy dekonwolucyjnej danych
kalorymetrycznych, opisanych w rozdziale 4, do opisu przemian konformacyjnych
zachodzących w cząsteczce albuminy. Śledząc doniesienia literaturowe,
można się dopatrzyć stosowania uproszczeń interpretacyjnych i niezgodności
między modelami proponowanymi do opisu procesu termicznego rozfałdowania
albuminy. Zostało to uwzględnione w dyskusji zagadnień przeanalizowanych
w niniejszej pracy.
Ważnym celem podjętych prac badawczych było wykazanie różnic w przebiegu
procesu termicznego rozfałdowania albuminy pozbawionej kwasów tłuszczowych
oraz nieodtłuszczonej. Problem przyłączania kwasów tłuszczowych do
albuminy był w ostatnich latach szeroko badany, co zrelacjonowano krótko
w rozdziale D I Dodatku. Konsekwencje dowiedzionych zmian konformacyjnych
albuminy, związanych z przyłączaniem kwasów tłuszczowych (CURRY et al., 1998;
SUGIO et al., 1999; BHATTACHARYA et al., 2000), nie zostały jeszcze dostatecznie
poznane. W bieżącej pracy dużo uwagi poświęcono dyskusji na temat odmiennych
reakcji obydwu form albuminy na działanie stosowanych czynników fizykochemicznych.
Na osiągnięcie tego celu złożyło się kilka pośrednich zadań badawczych:
charakterystyka termicznego rozfałdowania albuminy odtłuszczonej i zawierającej
kwasy tłuszczowe w roztworach wodnych oraz w roztworach etanolu, zbadanie
różnic w wiązaniu etanolu oraz porównanie wpływu promieniowania UV na różniące się
zawartością kwasów tłuszczowych formy albuminy.
Aby uwiarygodnić wnioski płynące z porównania wyznaczonych parametrów
termodynamicznych oraz obserwowanych tendencji ich zmian, przeprowadzono
analizę statystyczną prezentowanych wyników w programie STATISTICA 7.0 (Dodatek D V).


SPIS TREŚCI :

Wprowadzenie

1. Białka: konformacja, pojemność cieplna

1.1. Stan konformacyjny białka
1.2. Pojemność cieplna białek

2. Albumina — struktura i funkcje

3. Badania DSC białek

3.1. Termiczne rozfałdowanie białka
3.2. Aspekty kinetyczne w procesie denaturacji białek — model Lumry—Eyringa

4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC

4.1. Podstawy analizy dekonwolucyjnej
4.2. Przejścia niezależne
4.2.1. Model niezależnych przejść dwustanowych, uwzględniający efekty ΔCp
4.2.2. Model niezależnych przejść dwustanowych, z wykluczeniem efektów ΔCp
4.2.3. Model niezależnych przejść niedwustanowych
4.3. Przejścia sekwencyjne
4.4. Pojedyncze przejście dwustanowe z dysocjacją podjednostek

5. Proces termicznej denaturacji albuminy w roztworach wodnych

5.1. Charakterystyka DSC termicznej przemiany pomiędzy stanem natywnym i zdenaturowanym albuminy
5.2. Specyfika termicznych przemian konformacyjnych albuminy ludzkiej i wołowej
5.3. Wpływ obecności kwasów tłuszczowych na charakter termicznego rozfałdowania albuminy
5.4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC albuminy

6. Termiczna denaturacja albuminy surowicy w roztworach wodnych modyfikowanych wybranymi czynnikami chemicznymi

6.1. Przemiany BSA w roztworach o pH w zakresie 3,5—7,0
6.2. Proces termicznej denaturacji HSA i HSAf w roztworach wodnych etanolu
6.2.1. Białka w roztworach wodno-alkoholowych
6.2.2. Proces termicznej denaturacji HSA i HSAf w obecności etanolu
6.2.3. Wiązanie etanolu do albuminy
6.2.4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC albuminy w roztworach etanol-woda

7. Skutki ekspozycji roztworów wodnych albuminy na wybrane zakresy promieniowania elektromagnetycznego

7.1. Wpływ promieniowania o częstości radiowej na trwałość konformacji albuminy wołowej
7.2. Konformacyjna reorganizacja albuminy pod wpływem promieniowania UV

Podsumowanie

Dodatek

D I. Wiązanie kwasów tłuszczowych do albuminy
D II. Siły stabilizujące strukturę białka
D III. Wpływ środowiska na konformacyjną stabilność makromolekuły białka
D IV. Pomiary kalorymetryczne i spektrofotometryczne
D V. Analiza statystyczna wyników

Literatura

Summary
Zusammenfassung

KAŻDY OFEROWANY EGZEMPLARZ JEST SPRAWDZANY
W CELU WYKLUCZENIA EWENTUALNYCH
DEFEKTÓW DRUKARSKICH !


ZAPRASZAMY DO PRZEJRZENIA PEŁNEJ OFERTY KSIĘGARNI E-KODEKS !!!


W przypadku dodatkowych pytań proszę przesłać wiadomość.